مقدمه جنس یرسینیا با پذیرفتن نامهای متعددی چون فلاوباکتریوم پسودومولئی، باکتریوم انتروکلی تیکا، پاستور لاپسودوتوبرکلوزیس، پاستور X و ژرم X نهایتا از سال 1974 از خانواده پاستور لاسه جدا و به همراه سه گونه اصلی یرسینیاپستیس، یرسینیا پسودوتوبرکلوزیس و یرسینیا انتروکلی تیکا بطور قطعی در خانواده آنتروباکتریا سه جای گرفت.
این باکتریها از جمله بیماری زاهای مشترک انسان و دام هستند و مهم ترین گونهای که نقش آن در بیماری زایی انسان از سال 1965 به اثبات رسیده است یرسینیا انتروکلی تیکا میباشد، شیر خام، گوشت، سبزیجات و آب میتواند بعنوان منبع آلودگی این باکتری مطرح باشد.
یرسینیا انتروکلی تیکا میتواند عامل بیماری معدی رودهای، آدنیت مزانتریک، اریتم گرهدار عفونت خونی و پلی آرتریت باشد.
این ارگانیسم، کوکو باسیلی است گرم منفی، بدون کپسول، بیهوازی اختیاری بطول 1-3 میکرومتر و عرض 0/5 - 0/8 میکرومتر که حرکت آن فقط در دمای پائین تر از 30 درجه سلسیوس به کمک فلاژلهای پیرامونی صورت میگیرد.
دمای مناسب رشد آن 28-29 درجه سلسیوس PH مناسب آن 7/2 - 7/4 است و مانند اکثر آنتروباکتریاسهها گلوکز را بدون گاز تخمیر میکند و اکسیداز منفی است.
سروتیپهای جدیدی چون 0:13a; 13b, 0:4,32, 0:5,27, 0:21 بیماریزا تشخیص داده شدهاند.
بیشترین سروتیپهای بیماریزا 0:3 0:8, 0:9 میباشد.
از نظر سرولوژی آگلوتیناسیونهای متقاطع با ارگانیسمهایی مانند سالمونلا، بروسلا، شیگلا، اشری شیاکلی و ویبربو گزارش شده است.
1 هدف و دامنه کاربرد هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است .
این روش در مورد فرآوردههای غذایی انسان و دام کاربرد دارد .
2 واژهها و تعاریف در این استاندارد واژهها با تعاریف زیر بکار میروند : هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است .
2 واژهها و تعاریف در این استاندارد واژهها با تعاریف زیر بکار میروند : 2 1 یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا باکتریهای سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنههای ویژهای ایجاد مینمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت میکند .
در این استاندارد واژهها با تعاریف زیر بکار میروند : 2 1 یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا باکتریهای سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنههای ویژهای ایجاد مینمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت میکند .
2 2 شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکا شامل حضور یا عدم حضور این باکتری در مقدار معینی از فرآورده غذایی است که بر طبق روش مشروح در این استاندارد تعیین میشود .
3 اساس آزمایش شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت میگیرد .
3 1 غنی سازی در محیط مایع انتخابی 3 1 1 کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر : شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت میگیرد .
3 1 غنی سازی در محیط مایع انتخابی 3 1 1 کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر : الف آبگوشت نمک های صفراوی و سوربیتول و پپتن Peptone Sorbitol and Bile salts Broth (PSB ) ب : آبگوشت ایرگازان تیکارسیلین وکلرات پتاسیم Jrgasan ticarcillin and Potassium chlorate broth (ITC) 3 1 2 گرمخانه گذاری کشت (PSB) در دمای 25 22 درجه سلسیوس بمدت 3 تا 5 روز کشت (ITC) در دمای 25 22 درجه سلسیوس بمدت 2 روز (48 ساعت ) 3 2 کشت در محیطهای جامد کشت سطحی از محیطهای PSB.ITC بترتیب در محیطهای جامد زیر : 3 2 1 محیط سفسولودین ایرگازان و نووبیوسین آگار Cefsulodin Irgasan and novobiocin agar (CIN) 3 2 2 محیط سالمونلا شیگلا آگار حای ذرکسی کلات سدیم و کلرور کلسیم Salmonella / Shigella agar with Sodium desoxychlate and Calcium chloride (SSDC) 3 2 3 گرمخانه گذاری محیطهای CIn و SSDC در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .
پس از 24 ساعت و در صورت لزوم پس از 48 ساعت متناسب با محیط , کشت ها را به منظور حضور پرگنه های ویژه یرسینیا آنتروکلی تیکا بررسی کنید .
3 3 تایید در این مرحله روی پرگنههای مشکوک به یرسینیا آزمایشهای بیوشیمیایی , آزمایش های خاص منطبق با معیارهای بیماری زایی و در صورت امکان آزمایش های سرولوژیکی برای تایید انجام میشود .
به راهنمای روش کار مراجعه شود .
4 ـ محیطهای کشت ومعرف های لازم 4 ـ 1 ـ کلیات بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت و معرفها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات محیطها , جزییات مربوط به تقسیم و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است .
4 ـ 2 ـ محیطهای غنی کننده 4 ـ 1 ـ کلیات بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت و معرفها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات محیطها , جزییات مربوط به تقسیم و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است .
4 ـ 2 ـ محیطهای غنی کننده 4 ـ 2 ـ 1 ـ محیط مایع حاوی پیتن , سوربیتول و نمکهای صفرا (PSB) 4 ـ 2 ـ 2 محیط مایع حاوی ایرگازان ـ تیکارسیلین وکلرات پتاسیم (ITC) 4 ـ 3 ـ محیطهای کشت 4 ـ 3 ـ 1 ـ سفسولودین ـ ایرگازان و نووبیوسین حاوی آگار (CIN) 4 ـ 3 ـ 2 ـ سالمونلا ـ شیگلا آگار حاوی ذرکسی کلات سدیم و کلرور سدیم (SSDC) 4 ـ 3 ـ 3 ـ نوترنیت آگار 4 ـ 4 ـ محیط های شناسایی ومعرفها 4 ـ 4 ـ 1 ـ محیط کشت اوره تریپتوفان 4 ـ 4 ـ 2 ـ معرف شناسایی تریپتوفان دی آمیناز 4 ـ 4 ـ 3 ـ کلیگر آگار 4 ـ 4 ـ 4 ـ معرف تشخیص اکسیداز 4 ـ 4 ـ 5 ـ محیط های کشت دکربوکسیلاز 4 ـ 4 ـ 5 ـ 1 ـ محیط کشت لایزین دکربوکسیلاز 4 ـ 4 ـ 5 ـ 2 ـ محیط کشت اورنی تین دکربوکسیلاز 4 ـ 4 ـ 6 ـ محیط برای تخمیر قندها ( ساکارز ( رامنوز یا سالیسین ) 4 ـ 4 ـ 7 ـ محیط سیمون سیترات 4 ـ 4 ـ 8 ـمحیط صفرا و اسکولین آگاردار 4 ـ 4 ـ 9 کازئین سویا اگاردار 4 ـ 4 ـ 10 ـ کارتین سویا آگار دار برای شناسایی آمیداز 4 ـ 4 ـ 11 ـ محلول سولفات آمونیوم و آهن دو ظرفیتی برای شناسایی پیرازین آمیداز مازئین سویا آگاردار حاوی منیزیم وآگزالات 4 ـ 5 ـ سرم فیزیولوژی 4 ـ 6 ـ پتاسیم هیدروکساید در سرم فیزیولوژی 4 ـ 7 ـ محیط SIM آگار 5 ـ وسایل ضروری یادآوری : بجای ظرف شیشهای چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب میتوان استفاده کرد.
.
5 ـ 1 ـ وسیله سترون کردن خشک ( آون ) یا سترون کردن مرطوب ( اتوکلاو ) 5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظیم در 22±1درجه سلسیوس و 25±1درجه سلسیوس.
یادآوری : بجای ظرف شیشهای چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب میتوان استفاده کرد.
5 ـ 3 ـ قفسه خشک کردن یا آون دارای تهویه هوا با جابجایی و قابل تنظیم در 37±1 درجه و 55±1 درجه سلسیوس 5 ـ 4 ـ حمام آب قابل تنظیم در دمای 45±0/5درجه سلسیوس و 50±0/5درجه سلسیوس 5 ـ 5 ـ لولههای آزمون با ابعاد 180*18 و 180*9 و 50*12 میلی متر 5 ـ 6 ـ ظروف شیشه ای و بطری های با گنجایش مناسب 5 ـ 7 ـ ظروف پتری شیشهای یا پلاستیکی بقطر 100 ـ 90 میلی متر 5 ـ 8 ـ پی پتهای 1 و 10 میلی لیتری با درجه بندی 0/1 میلی لیتر 5 ـ 9 ـ مکندههای لاستیگی ( پوآر ) مخصوص پی پت 5 ـ 10 ـ حلقه کشت بقطر تقریبی 3 میلی متر و سوزن کشت سر صاف از جنس پلاتین / ایریدوم یا نیکل / کروم و یا پی پت پاستور شیشهای بجای سوزن کشت .
یادآوری : حلقه و سوزن کشت یکبار مصرف میتواند استفاده شود حلقه کشت از جنس نیکل / کرم برای انجام آزمون اکسیداز مناسب نیست .
5 ـ 11 ـ PH متر بادقت ±0/1 واحد PH در 25 درجه سلسیوس 5 ـ 12 ـ منبع نور مناسب برای تابش مورب 5 ـ 13 ـ ذره بین یا میکروسکوپ 5 ـ 14 ـ مخلوط کن ( استوماکر ) 6 ـ نمونه برداری نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده غذایی برای آزمایشهای میکربی صورت گیرد .
نمونهای که به آزمایشگاه میرسد باید معرف واقعی کالا بوده و در حین نمونه برداری و حمل و نقل دچار آسیب دیدگی و تغییر نشده باشد .
7 ـ آماده کردن نمونه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .
نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده غذایی برای آزمایشهای میکربی صورت گیرد .
8 ـ روش آزمایش 8 ـ 1 ـ سوسپانسیونهای اولیه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .
8 ـ روش آزمایش 8 ـ 1 ـ سوسپانسیونهای اولیه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن را مخلوط کنید تا یکنواخت شود .
8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسیون دیگری از نمونه , با محیط ITC با رقت وزن به حجم یا حجم به حجم تهیه کنید .
8 ـ 1 ـ سوسپانسیونهای اولیه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن را مخلوط کنید تا یکنواخت شود .
8 ـ 2 ـ غنی سازی 1 8 ـ 2 ـ 1 ـ محیط PSB کشت شده را در 25 ـ 22 درجه سلسیوس بمدت 5 روز بدون هم زدن و 2 تا 3 روز با هم زدن قرار دهید .
8 ـ 2 ـ 2 ـ محیط ITC کشت شده را در 25 درجه سلسیوس برای 2 ورز (48 ساعت ) گرمخانه گذاری کنید .
8 ـ 3 ـ کشت 8 ـ 3 ـ 1 ـ با حلقه کشت از محیط (PSB) بردارید و روی محیط جامد (CIN) طوری کشت دهید که پرگنه های مجزا حاصل شود .
8 ـ 3 ـ 2 ـ با پی پت سترون , 0/5 میلی لیتر از کشت PSB را به 4/5 میلی لیتر محلول پتاسیم هیدروکساید ( محیط شماره 20 پیوست ) بیفزایید و خوب مخلوط کنید و بعد از 20 ثانیه با حلقه کشت از ان بردارید و در سطح محیط (CIN) طوری کشت دهید که پرگنههای مجزا حاصل شود .
8 ـ 3 ـ 3 ـ با حلقه کشت از ITC کشت شده بردارید و در سطح جامد SSDC برای حصول پرگنههای مجزا کشت دهید .
8 ـ 3 ـ 4 ـ ظروف پتری بندهای 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 ـ و 8 ـ 3 ـ 3 را بطور وارونه در گرمخانه در دمای 30 درجه سلسیوس برای 24 ساعت قرار دهید .
8 ـ 3 ـ 5 ـ ظروف پتری را از گرمخانه خارج و آنها را به منظور شناسایی پرگنه های ویژه یرسینیا آنتروکلی تیکا در نور مایل (45 درجه ) با ذره بین بررسی کنید .
الف - پرگنه های یرسینیا آنتروکلی تیکا در محیط CIN کوچک ( برابر یا کوچکتر از یک میلی متر ) صاف یا مرکز قرمز و حاشیه شفاف و در زیر نور مایل با ظاهری گرانول دار ریز و بدون قوس و قزح است .